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代謝組學(xué)入門基礎(chǔ)知識篇

  代謝組學(xué)(Metabolomics)是生物體內(nèi)生化反應(yīng)的總成,是生命體維持生命的物質(zhì)基礎(chǔ),也是研究生命活動(dòng)的重要基礎(chǔ)。代謝組學(xué)是基于高通量分析和生物信息學(xué)技術(shù),研究生命在內(nèi)、外環(huán)境影響下的內(nèi)源代謝活動(dòng),包括對代謝產(chǎn)物種類、數(shù)量及其變化規(guī)律的檢測和分析,從而研究集體生命活動(dòng)發(fā)生和發(fā)展的本質(zhì)。代謝物作為生物學(xué)過程的終端產(chǎn)物,其狀態(tài)改變能夠準(zhǔn)確地反應(yīng)細(xì)胞功能的變化。研究表明,包括癌癥在內(nèi)的多種疾病,如肝臟疾病、腎病、心血管和神經(jīng)系統(tǒng)疾病等都與細(xì)胞內(nèi)代謝狀態(tài)改變導(dǎo)致的生理學(xué)紊亂或細(xì)胞功能缺失相關(guān)聯(lián)。代謝組學(xué)已成為后基因組學(xué)時(shí)代功能基因組學(xué)的研究利器,是大規(guī)模篩選用于疾病的早期預(yù)測、診斷和分型的新生物標(biāo)志物的重要手段,是精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的重要技術(shù)手段之一。

  代謝組學(xué)優(yōu)勢 代謝物的種類、數(shù)量變化易于檢測; 相比于基因組學(xué)和蛋白組學(xué),技術(shù)手段更為簡單; 與基因組學(xué)和的蛋白組學(xué)相比,代謝物數(shù)量少,易于檢測、驗(yàn)證和分析; 代謝水平變化可實(shí)時(shí)揭示機(jī)體生理病理狀態(tài)。

代謝組學(xué)分類

  代謝組學(xué)根據(jù)研究目的的不同,可進(jìn)一步分為非靶向和靶向代謝組學(xué)。

  非靶向代謝組學(xué)(Untargeted Metabolomics)是指采用 LC-MS、GC-MS、NMR技術(shù),無偏向性的檢測細(xì)胞、組織、器官或者生物體內(nèi)受到刺激或擾動(dòng)前后所有小分子代謝物(主要是相對分子量1000 Da以內(nèi)的內(nèi)源性小分子化合物) 的動(dòng)態(tài)變化,并通過生信分析篩選差異代謝物,對差異代謝物進(jìn)行通路分析,揭示其變化的生理機(jī)制。

  靶向代謝組學(xué)(Targeted Metabolomics)是針對特定一類代謝物的研究分析。二者各有優(yōu)缺點(diǎn),經(jīng)常結(jié)合使用,用于差異代謝產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)和定量,對后續(xù)代謝分子標(biāo)志物進(jìn)行深入的研究和分析,這在食品鑒定、疾病研究、動(dòng)物模型驗(yàn)證、生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)、疾病診斷、藥物研發(fā)、藥物篩選、藥物評估、臨床研究、植物代謝研究、微生物代謝研究中發(fā)揮重要作用。

代謝組學(xué)應(yīng)用方向

  1、生物樣本中復(fù)雜代謝產(chǎn)物的檢測。

  2、尋找疾病的生物標(biāo)志物。

  3、標(biāo)志物的驗(yàn)證和絕對定量研究。

  4、研究代謝通路機(jī)制。

代謝組平臺(tái)

  非靶向代謝組學(xué)常用LC/MS、GC/MS、NMR三種檢測手段,優(yōu)缺點(diǎn)如下表:

  1. NMR(核磁共振)

  優(yōu)點(diǎn)是對樣品無破壞性,測定無偏向性,即適用于血液、尿液體液等液體樣品,也適用于組織和器官等固體樣品,并且測定速度快,可實(shí)現(xiàn)樣品代謝組的動(dòng)態(tài)監(jiān)測,缺點(diǎn)主要是分辨率較低。

  2. GC-MS(氣相色譜)

  GC-MS是代謝組學(xué)研究的技術(shù),具有技術(shù)成熟穩(wěn)定、分辨率高等特點(diǎn),同時(shí),由于具有相對完善的數(shù)據(jù)庫,使得定性也好一些,缺點(diǎn)則主要表現(xiàn)在樣品處理復(fù)雜,并且對于不易衍生化的物質(zhì)定性和定量較困難,影響了該技術(shù)在更大范圍內(nèi)的使用。

  3. LC-MS(液相色譜)

  優(yōu)點(diǎn)主要表現(xiàn)在樣品制備和前處理簡單、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好,分辨率高,分離和分析范圍大,缺點(diǎn)則主要表現(xiàn)在數(shù)據(jù)庫完善程度不夠,定性相對困難。

非靶向性代謝組學(xué)分析技術(shù)

  代謝組學(xué)常常需要運(yùn)用多種分析技術(shù)手段來滿足不同的實(shí)驗(yàn)需求。常見的代謝組學(xué)分析技術(shù)包括核磁共振(NMR)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)、毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用(CD-MS)、HILIC--MS等。高分辨質(zhì)譜技術(shù)主要有TOF-MS、FTICR-MS、Orbitrap-MS、Sector-MS等。

  1. GC-MS(氣相色譜)是代謝組學(xué)研究的經(jīng)典技術(shù),具有技術(shù)成熟穩(wěn)定、分辨率高等特點(diǎn),同時(shí),由于具有相對完善的數(shù)據(jù)庫,使得定性也更為準(zhǔn)確,缺點(diǎn)則主要表現(xiàn)在樣品處理復(fù)雜,并且對于不易衍生化的物質(zhì)定性和定量較困難,影響了該技術(shù)在更大范圍內(nèi)的應(yīng)用。

  2. LC-MS(液相色譜)優(yōu)勢主要表現(xiàn)在樣品制備和前處理簡單、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好,分辨率高,分離和分析范圍廣,缺點(diǎn)則主要表現(xiàn)在數(shù)據(jù)庫完善程度不夠,定性相對困難。

數(shù)據(jù)分析

  數(shù)據(jù)預(yù)處理:利用XCMS、MZmine和MarkerView等工具進(jìn)行原始數(shù)據(jù)處理。 鑒定差異代謝物:常用的分析方法包括主成分分析(PCA)、偏最小二乘判別分析(PLS-DA)、正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)等。數(shù)據(jù)分析結(jié)果還需要經(jīng)過t檢驗(yàn)和變量權(quán)重重要性排序(variable importance in projection, VIP)值篩選差異性代謝產(chǎn)物。一般認(rèn)為,同時(shí)滿足P<0.05,VIP>1.0的變量為差異代謝物。 代謝通路分析:常見的代謝組學(xué)通路數(shù)據(jù)庫包括HMDB、KEGG、Reactome、BioCyc、MetaCyc等數(shù)據(jù)庫,可以利用這些數(shù)據(jù)庫進(jìn)行代謝通路和互作網(wǎng)絡(luò)分析。

關(guān)于樣品

  1. 微生物和細(xì)胞樣本:迅速鈍化代謝活動(dòng)(淬滅),同時(shí)保持細(xì)胞不裂解

  2. 動(dòng)物體液(如尿、血、組織、器官、唾液):采樣后要迅速預(yù)處理,如加入抗凝血?jiǎng)?、防腐劑,并立即冷凍處?-80℃)

  3. 植物樣本:采集后迅速冷凍(液氮),然后轉(zhuǎn)入-80℃保存,200mg/例

  4. 血清樣品:500ul/例(不得低于200ul/例),一定避免反復(fù)凍融。(血液收集在離心管中靜置30分鐘進(jìn)行凝固。然后離心取上清裝載于干凈的離心管中,再離心5分鐘,8000rpm,取上清分裝到凍存管中,每管0.5ml,-80℃凍存寄送。)

  5. 尿液樣品:1ml/例,原則上可以多取一點(diǎn)(尿液直接分裝到離心管中,每管1ml,添加一滴(約10ul)質(zhì)量體積為1/100(w/v)的疊氮化鈉,-80℃凍存寄送)

  6.瘤胃液:1ml/例,原則上可以多取一點(diǎn)。 收集步驟:瘤胃液經(jīng) 6000×g 離心15min,取上清,分裝, -80℃冷凍保存,干冰寄送。 為了讓樣品能保存更長的時(shí)間,取樣之后可添加一滴(約10µl)質(zhì)量體積為1/100(w/v)的疊氮化鈉溶液。

  關(guān)于生物學(xué)重復(fù)次數(shù)

  一般來說,植物、細(xì)胞、微生物等至少6個(gè)生物學(xué)重復(fù),動(dòng)物樣本,由于其個(gè)體化差異較大,包括組織、血、尿液等至少10個(gè)生物學(xué)重復(fù)。臨床樣本,個(gè)體差異更大,血漿、尿液等至少要在30個(gè)生物學(xué)重復(fù)左右,無上限。具體根據(jù)文章發(fā)表檔次和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)而定。

 

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