如果能夠建立識別單個蛋白質(zhì)中單氨基酸分辨率的工具對于細胞生物學(xué)的研究將有巨大的推動作用。但目前能做得到的是對基因序列進行測序，但是無論是DNA基因組還是RNA轉(zhuǎn)錄組都不能帶給我們對于蛋白質(zhì)的全面認識，因為蛋白質(zhì)中還包含翻譯后修飾以及剪接相關(guān)的信息。因此，在單分子水平上能夠直接將蛋白質(zhì)測序并檢測翻譯后修飾的穩(wěn)健方法將極大地有利于蛋白質(zhì)組學(xué)的研究，促進對于低豐度蛋白以及翻譯后修飾分布的檢測。為此，荷蘭代爾夫特理工大學(xué)研究組在發(fā)文題為，Multiple rereads of single proteins at single-amino acid resolution using nanopores，提供了一種基于納米空測序的單分子蛋白閱讀器，可以以高保真度和高通量區(qū)分單個蛋白質(zhì)在單一氨基酸分辨率下的信息。

　　納米孔測序是一種單分子DNA測序技術(shù)，該技術(shù)能夠在便攜式平臺上以最小的成本長時間讀取和檢測表觀遺傳標記，最早起源于上世界80年代的幾個實驗室。在納米孔測序中，納米孔作為生物傳感器提供了唯一的通道，使兩種不同的離子溶液被電壓為基礎(chǔ)的膜給隔開，形成順式一側(cè)和反式一側(cè)。分子通過納米孔的時候在順反兩側(cè)產(chǎn)生離子電流，通過聚合酶或者解旋酶與多核苷酸緊密結(jié)合，逐步控制核苷酸通過納米孔，不同堿基產(chǎn)生不同的電流，從而讀出核苷酸序列。因此，納米孔最窄的孔徑區(qū)域就是其傳感區(qū)域，通過納米孔和沿著核苷酸行走的解旋酶，促使DNA以一個一個堿基的方式通過納米孔。

　　圖1 納米孔技術(shù)

　　有人曾經(jīng)提出假設(shè)，可以利用納米孔技術(shù)對蛋白質(zhì)也進行單個氨基酸的測序，研究表明小肽片段通過納米孔自由轉(zhuǎn)運的方式可以對單個氨基酸表現(xiàn)出敏感性，但是目前尚缺乏地確定氨基酸順序以及重建蛋白質(zhì)序列的方法。為此，作者們。該鏈由一條80個核苷酸的DNA鏈組成，通過疊氮化合物修飾共價鏈接一個26氨基酸的合成肽，該肽段中富含帶負電的氨基酸比如天冬氨酸和谷氨酸，這樣通過電滲力將多肽拉過納米孔。納米孔使用的突變型的MspA，具有杯子的形狀，可以將解旋酶從離子電流阻塞的孔收縮過程中分離出約10 nm。對于DNA易位動力蛋白酶，作者們使用的是Hel308 DNA解旋酶。使用該解旋酶是因為通過MspA拉動DNA單鏈每次的長度是0.33nm，剛好是單個氨基酸的步長，另外該解旋酶比較穩(wěn)定且能夠耐受高鹽，而且其拉力大于50pN可以解開任何的靶標多肽的二級結(jié)構(gòu)。

　　圖2 通過納米孔閱讀單肽

　　作者們發(fā)現(xiàn)，類似于DNA序列的納米孔讀取，通過納米孔的多肽會在離子流中產(chǎn)生一個獨特的階梯狀模式。每次讀取時離子電流步驟的持續(xù)時間各不相同，但水平序列信號特征具有高度的可重復(fù)性。通過建立識別軟件，作者們可以準確識別電流信號，并對電流中值進行分析，從而回溯確認序列的信息。

　　圖3 DNA-肽結(jié)合體通過納米孔以及電流讀數(shù)

　　進一步地，作者們想對該系統(tǒng)的精確性進行分析，因此作者們構(gòu)建了不同的DNA-肽結(jié)合體，但是每個結(jié)合體中只改變某一個氨基酸，從而可以確認在單氨基酸改變的情況下該系統(tǒng)是否能夠識別出不同。作者們發(fā)現(xiàn)電流信號在多個水平上具有差異，表明即使是單一氨基酸的替換也可以被該系統(tǒng)區(qū)分出來。為了定量評估對于多肽變異的可區(qū)分性，作者們進行了混淆矩陣的計算，發(fā)現(xiàn)可以以87%的平均準確率識別氨基酸變體。作者們發(fā)現(xiàn)通過連續(xù)控制解旋酶對同一分子進行多次獨立的重新讀取，可以消除導(dǎo)致納米孔讀取不準確的隨機錯誤，從而大幅度提高納米孔蛋白讀取器的識別保真度。

　　但作者們對該方法的局限性也進行了分析，發(fā)現(xiàn)納米孔可以能夠順利轉(zhuǎn)運帶有中性極性、非極性以及正電極性的氨基酸多肽，但是高正電荷的多肽易位轉(zhuǎn)運的效率很有限。但幸運的是，通過對人類蛋白質(zhì)組的分析顯示，帶負電荷的蛋白質(zhì)序列比帶正電荷的蛋白質(zhì)序列更常見。

　　總的來說，該工作建立了能夠以單氨基酸精度進行多肽測序的方法，不需要對設(shè)備進行重新的設(shè)計只需要改變樣品制備和對電流信號進行數(shù)據(jù)分析的軟件即可達到目標。該工具仍然保留了納米孔進行DNA測序的特點，低成本、且對單個分子的微小物理變化非常敏感。該工作向著低成本蛋白質(zhì)測序的邁出了新的一步，能夠?qū)崿F(xiàn)單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究，為基礎(chǔ)生物學(xué)和臨床中的應(yīng)用提供了新的思路。

　　原文鏈接：

　　https://www.science.org/doi/10.1126/science.abl4381

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