通過基因工程技術(shù)將T細(xì)胞激活，并裝上定位導(dǎo)航到腫瘤的裝置-腫瘤嵌合抗原受體(Chimeric Antigen Receptor, CAR)，可以將T細(xì)胞這個普通“武器”改造成“超級武器”，即為CAR-T細(xì)胞。CAR-T是治療B細(xì)胞惡性腫瘤的有效療法，但在實體瘤中療效有限。這些限制性的因素包括：腫瘤部位T細(xì)胞的遷移和浸潤不足、抑制信號的持續(xù)存在、腫瘤限制性抗原的缺乏。此外，CAR-T療法的治療潛力也取決于CAR-T與腫瘤細(xì)胞之間形成裂解免疫突觸(Lytic Immune Synapse, IS)的形成。

　　糖基化是最常見的蛋白質(zhì)修飾之一，產(chǎn)物以糖蛋白的形式出現(xiàn)。糖蛋白是聚糖與蛋白質(zhì)的天冬酰胺或絲氨酸、蘇氨酸殘基共價連接而成。與正常細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞往往表現(xiàn)出異常的糖基化，形成一種極其多樣的細(xì)胞外聚糖外衣。這種聚糖外衣可能通過屏蔽免疫細(xì)胞的抗原表位或干擾免疫細(xì)胞功能，對抗腫瘤反應(yīng)產(chǎn)生不利影響。b1–6N-聚糖分支增多是腫瘤細(xì)胞最頻繁的變異之一，該糖基化修飾是N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶V(由MGAT5基因編碼)活性增加的結(jié)果。MGAT5的表達(dá)受Ras-Raf-Ets信號通路的正向調(diào)控，該通路在腫瘤中通常異常激活，并直接參與腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移，在多種腫瘤模型中均被證明與生存降低和預(yù)后不良相關(guān)。

　　2022年1月19日，來自意大利的研究人員發(fā)現(xiàn)多種腫瘤的細(xì)胞外N-聚糖表達(dá)豐度與CAR-T細(xì)胞殺傷程度呈負(fù)相關(guān)。他們通過敲除胰腺癌(PAC)中的MGAT5發(fā)現(xiàn)，N-聚糖能干擾免疫突觸形成，減少轉(zhuǎn)錄激活、細(xì)胞因子和細(xì)胞毒性，保護(hù)腫瘤免受CAR-T細(xì)胞的殺傷。這意味著，一旦破壞腫瘤細(xì)胞上的N-聚糖這層“糖衣”，CAR-T細(xì)胞活性即得到增強，成為殺傷胰腺癌的重磅“炮彈”。研究成果在線發(fā)表于最新一期的Science Translational Medicine(STM)。

　　研究成果(圖源：STM)

　　為了揭示N-聚糖在胰腺癌中的生物學(xué)作用，研究人員首先利用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫分析了參與這些糖基合成的糖基轉(zhuǎn)移酶的突變情況，發(fā)現(xiàn)cBioportal的3738名患者中，有19%樣本攜帶參與N-聚糖合成的糖基轉(zhuǎn)移酶的基因組改變，且這一特征與不良預(yù)后相關(guān)。進(jìn)一步分析確定僅分支型N-聚糖合成的基因變異與惡化的無病生存顯著相關(guān)，且大多數(shù)變異都是基因擴增。結(jié)合TCGA數(shù)據(jù)庫中胰腺癌樣本的RNA測序數(shù)據(jù)的富集分析顯示，與健康對照組相比，患者中分支型N-聚糖合成通路顯著富集。在富集的基因中，研究者重點關(guān)注了分支型N-聚糖生物合成的關(guān)鍵基因MGAT5。

　　胰腺癌患者的N-聚糖合成相關(guān)的基因變異及預(yù)后(圖源：STM)

　　敲除MGAT5后發(fā)現(xiàn)，CAR-T細(xì)胞44v6.28的抗腫瘤效果顯著增強，表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞溶解活性增加，干擾素和腫瘤壞死因子水平上升。這些結(jié)果說明，分支型N-聚糖屏蔽了CAR-T對胰腺癌抗原44v6.28的靶向性。

　　敲除MGAT5后腫瘤細(xì)胞與CAR-T細(xì)胞的變化(圖源：STM)

　　為了探明N-聚糖缺陷腫瘤細(xì)胞使得抗腫瘤療效增強的基礎(chǔ)，研究者分析了CAR-T細(xì)胞靶向過程的限制性步驟——免疫突觸IS的形成。結(jié)果顯示，缺乏MGAT5聚糖產(chǎn)物的胰腺癌細(xì)胞與CAR-T 44v6.28之間形成了良好的IS，具有更高的F-肌動蛋白積累，更強的顆粒聚合，以及MTOC到F-肌動蛋白的距離縮短，這些是功能性細(xì)胞溶解的三個公認(rèn)參數(shù)。對照組細(xì)胞中則沒有觀察到這種差異。該團隊還結(jié)合Jurkat細(xì)胞模型來分析細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)事件，也得到與上述一致的結(jié)論。這些發(fā)現(xiàn)支持了胰腺癌對CAR-T細(xì)胞治療的抵抗機制，即腫瘤接觸和CAR-T信號強度受分支型N-聚糖的調(diào)控。

　　敲除MGAT5后免疫突觸與功能性細(xì)胞溶解情況(圖源：STM)

　　既然基因?qū)用鎸-聚糖的抑制顯示出了良好效果，那么從藥理學(xué)上克服腫瘤糖基化是否也能取得類似效果?研究者巧妙地利用葡萄糖/甘露糖類似物2DG來實現(xiàn)這一干預(yù)。2DG此前已被報道能干擾N-鏈糖基化，合并成新生糖蛋白的脂聯(lián)寡糖，引起糖基化整體異常狀態(tài)。研究人員發(fā)現(xiàn)，經(jīng)2DG處理的胰腺癌細(xì)胞能被44v6.28細(xì)胞更有效地殺死，并在44v6.28細(xì)胞中引發(fā)了更強的轉(zhuǎn)錄作用，但在對照細(xì)胞中卻沒有這種效應(yīng)。在胰腺癌小鼠異種移植模型中的實驗數(shù)據(jù)顯示，無論是低腫瘤負(fù)荷、高CAR-T細(xì)胞劑量模型，還是高腫瘤負(fù)荷、低CAR-T細(xì)胞劑量模型，2DG預(yù)先注射都能使得腫瘤對CAR-T細(xì)胞的攻擊更加敏感。此外，該研究還觀察到細(xì)胞表達(dá)抑制性受體的頻率顯著降低，如T細(xì)胞免疫球蛋白域和粘蛋白域3 (TIM-3)、淋巴細(xì)胞活化3、程序性細(xì)胞死亡蛋白1(PD-1)和CD57。其中，PD-L1的PD-1相互作用在N-聚糖去除后減弱最為顯著。這些發(fā)現(xiàn)表明，與2DG聯(lián)合使用不僅可以提高腫瘤清除能力，還可能使CAR-T細(xì)胞避免發(fā)生免疫檢查點的抑制。

　　2DG處理后胰腺癌對44v6.28細(xì)胞敏感度的影響(圖源：STM)

　　在高腫瘤負(fù)荷胰腺癌異種移植小鼠模型中，研究人員比較2DG和44v6.28細(xì)胞單獨以及組合的長期聯(lián)合治療。在T3M-4異種移植模型中，重復(fù)注射2DG單獨治療小鼠被證明是無益的，而2DG和44v6.28細(xì)胞組合提供了最持久的腫瘤控制，優(yōu)于兩種單獨治療方案。這一結(jié)果在BxPC3異種移植模型中亦得到證實。以上結(jié)果均表明，與2DG聯(lián)合治療可以提高44v6.28細(xì)胞的效力并減輕T細(xì)胞衰竭。不僅在胰腺癌，研究人員還發(fā)現(xiàn)與2DG共同治療可提高CAR-T細(xì)胞對包括膀胱癌和卵巢癌在內(nèi)的多種腫瘤的治療效果。

　　胰腺癌模型中2DG處理、44v6.28細(xì)胞治療的比較(圖源：STM)

　　總之，CAR-T細(xì)胞與2DG聯(lián)合治療胰腺癌展現(xiàn)出良好的潛力，并且在其他多種腫瘤的治療中也取得良好效果，包括來自肺、卵巢和膀胱的腫瘤。總的來說，這項研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外N-聚糖通過增加CAR-T細(xì)胞激活閾值和促進(jìn)CAR-T細(xì)胞衰竭使得腫瘤發(fā)生治療抵抗，也為合理改進(jìn)實體腫瘤治療方法提供了新的思路和方向。

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