心肌梗死(myocardial infarction,MI)是患者冠狀動(dòng)脈發(fā)生缺血缺氧所引起的心肌壞死，其發(fā)病迅速、病情兇險(xiǎn)，?？晌＜吧?。該疾病在歐美最常見，美國每年約有150萬人發(fā)生心肌梗死。中國近年來呈明顯上升趨勢，每年新發(fā)至少50萬。急性心肌梗死發(fā)生時(shí)心肌細(xì)胞的血氧不足，缺血心肌的多種炎癥因子被大量釋放，促進(jìn)心室重構(gòu)，進(jìn)而導(dǎo)致心臟肥大。這一過程中腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(renin angiotension aldosterone, RAAS)的過度激活發(fā)揮了重要作用。血管緊張素Ⅱ通過刺激成纖維細(xì)胞，產(chǎn)生膠原蛋白，促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大和心肌纖維化，從而形成心臟瘢痕組織。雖然瘢痕形成可預(yù)防心肌梗死后心臟破裂，但瘢痕組織往往缺乏彈性，限制心臟的高效跳動(dòng)能力，引起血流動(dòng)力學(xué)功能障礙和心律失常，從而導(dǎo)致心力衰竭。臨床上已將心肌梗塞后瘢痕組織的大小作為心血管預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測指標(biāo)，疤痕組織尺寸越大的患者出現(xiàn)心率問題、心力衰竭和心臟猝死的風(fēng)險(xiǎn)就越大。因此，科學(xué)家一直致力于探究如何減少瘢痕組織的形成，恢復(fù)心肌梗死后梗死灶的功能。

　　肌成纖維細(xì)胞活化狀態(tài)與纖維化瘢痕的產(chǎn)生、成熟以及心肌重塑有關(guān)，而動(dòng)態(tài)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞狀態(tài)過渡是心臟纖維化反應(yīng)的基礎(chǔ)。近日，來美國華盛頓大學(xué)的Jennifer Davis團(tuán)隊(duì)在Cell Stem Cell雜志在線發(fā)表了題為MBNL1 drives dynamic transitions between fibroblasts and myofibroblasts in cardiac wound healing的研究論文，揭示了在心臟創(chuàng)傷愈合過程中控制成纖維細(xì)胞狀態(tài)可塑性的分子開關(guān)MBNL1。作者發(fā)現(xiàn)，MI發(fā)生后，MBNL1的表達(dá)調(diào)控心臟成纖維細(xì)胞的增殖以及向肌成纖維細(xì)胞活化狀態(tài)的過渡和維持。該研究為研發(fā)治療心肌梗死的藥物提供了新思路和理論基礎(chǔ)。

　　肌成纖維細(xì)胞狀態(tài)是不穩(wěn)定并可逆的，而這些狀態(tài)轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵控制點(diǎn)是轉(zhuǎn)錄組成熟，它主要由RNA結(jié)合蛋白介導(dǎo)，如muscleblind-like 1(MBNL1)。MBNL1 通過穩(wěn)定、剪接、多腺苷酸化和定位其靶標(biāo) mRNA 來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄組。作者前期研究顯示，MBNL1缺失小鼠的心臟在損傷后肌成纖維細(xì)胞密度和纖維化瘢痕形成均有所下降。同時(shí)，在成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化過程中，血清反應(yīng)因子(serum response factor, SRF)和鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(calcineurin, can)等轉(zhuǎn)錄本是必需的，而它們受到MBNL1的調(diào)控。這些數(shù)據(jù)共同表明MBNL1在驅(qū)動(dòng)心臟纖維化前期狀態(tài)和纖維化中發(fā)揮重要作用，但這尚未在體內(nèi)得到明確證明。因此，作者在本研究中對上述推論進(jìn)行了深入探究。

　　首先作者在Postnlineage reporter mice(PostniCre-mT/mG，可以通過流式細(xì)胞儀分選不同狀態(tài)的成纖維細(xì)胞)中比較了靜息態(tài)成纖維細(xì)胞和心肌成纖維細(xì)胞的基因表達(dá)情況。與未標(biāo)記的靜息態(tài)成纖維細(xì)胞相比，在MI發(fā)生后的所有時(shí)間點(diǎn)中，Postn-traced成纖維細(xì)胞中的一些經(jīng)典的肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志基因顯著上調(diào)，包括Col1a1和Acta2。隨后，作者檢測了Mbnl1的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與靜息態(tài)的成纖維細(xì)胞相比，Postn-traced肌成纖維細(xì)胞中的Mbnl1基因表達(dá)水平顯著升高。此外，作者還檢測了來自心衰心臟(富含肌成纖維細(xì)胞的一種組織來源)的成纖維細(xì)胞，Mbnl1和Acta2顯著上調(diào)。這些數(shù)據(jù)表明在人和小鼠中，MBNL1的活性與肌成纖維細(xì)胞的形成相關(guān)。

　　那么MBNL1是否可以將心臟成纖維細(xì)胞(cardiac fibroblasts)轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞(myofibroblasts)呢?作者通過MBNL1條件性轉(zhuǎn)基因小鼠(MBNBL1 Tg-Tcf21iCre)，在心臟成纖維細(xì)胞中特異性地誘導(dǎo)過表達(dá)MBNL1。通過FACS(fluorescence-activated cell sorting)分選心臟成纖維細(xì)胞，隨后進(jìn)行RNA-seq測序和分析，鑒定出了420個(gè)差異表達(dá)(differential expression, DE)基因(MBNBL1 Tg-Tcf21iCrevs. NTG-Tcf21iCre)。在沒有發(fā)生損傷時(shí)，MBNL1的過表達(dá)足以將心臟成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組。與NTGs對照相比，在未損傷的MBNL1 Tg-Tcf21iCre成纖維細(xì)胞中，肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)錄標(biāo)記物(Acta2、Postn、Fn1、Lox和Col5a2)包含在前25個(gè)DE基因中。盡管MBNBL1過表達(dá)成纖維細(xì)胞具有促纖維化肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組，但兩組小鼠的心肌纖維化程度、aSMA+肌成纖維細(xì)胞數(shù)量、心臟結(jié)構(gòu)和功能均無明顯差異，因此作者推測需要額外的刺激來實(shí)現(xiàn)生理肌成纖維細(xì)胞表型。

　　為了展示出纖維化表型，作者對MBNL1 Tg-Tcf21iCre和NTG小鼠進(jìn)行了MI處理。與來源于NTG小鼠的心臟成纖維細(xì)胞相比，MI顯著地上調(diào)了MBNL1 Tg-Tcf21iCre小鼠(簡稱“Tg小鼠”)中的多個(gè)膠原基因(包括Col1a1,Col1a2,Col3a1,Col5a1和Col5a2)。與NTG小鼠相比，Tg小鼠心臟邊界區(qū)的膠原纖維變短，縮短分?jǐn)?shù)(fractional shortening)降低10%，并呈現(xiàn)出微弱的心室擴(kuò)張。有研究表明衰老MBNL1 Tg-Tcf21iCre小鼠在無損傷情況下促進(jìn)間質(zhì)纖維化，因此，作者先對MBNL1 Tg-Tcf21iCre和NTG小鼠進(jìn)行MI處理，待梗死瘢痕完全形成時(shí)(約3個(gè)月)再進(jìn)行檢測。雖然兩種小鼠中的纖維化瘢痕形成面積、肌成纖維細(xì)胞密度和心肌重構(gòu)依舊沒有明顯差異，但Tg小鼠中的瘢痕組織更成熟，這種增強(qiáng)的疤痕成熟與基質(zhì)成熟因子(如Lox和Runx1)的表達(dá)增加一致，說明MBNL1可以增加瘢痕組織的穩(wěn)定性。過表達(dá)的MBNL1可能通過兩種方式限制肌成纖維細(xì)胞數(shù)量：誘導(dǎo)凋亡或抑制傷口愈合的增殖階段。TUNEL染色顯示兩組小鼠中的成纖維細(xì)胞凋亡并沒有明顯區(qū)別，而細(xì)胞增殖檢測發(fā)現(xiàn)，Tg小鼠的心臟成纖維細(xì)胞的增殖與NTGs相比降低了20%左右，說明MBNL1會(huì)抑制MI誘導(dǎo)的心臟成纖維細(xì)胞的增殖。

　　隨后，作者在小鼠心臟成纖維細(xì)胞中特異性地敲除了MBNL1(MBNL1Fl/Fl-Tcf21iCre小鼠，簡稱為Fl-Tcf21iCre)，用于檢測MBNL1在心臟成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)化中的作用。在正常狀態(tài)下，心臟成纖維細(xì)胞特異性MBNL1缺失并不影響心臟功能，但在MI發(fā)生后，對照組小鼠(MBNLFl/Fl)會(huì)出現(xiàn)心室擴(kuò)張的表型，而Fl-Tcf21iCre小鼠不會(huì)發(fā)生心室擴(kuò)張。同時(shí)，F(xiàn)l-Tcf21iCre小鼠中的纖維化和肌成纖維細(xì)胞密度比對照組減少了40%左右，說明在肌成纖維細(xì)胞的形成和纖維化過程中MBNL1是必要的。作者還發(fā)現(xiàn)Fl-Tcf21iCre心臟的膠原纖維寬度和排列也降低了，說明敲除MBNL1會(huì)阻礙瘢痕組織的成熟和穩(wěn)定。MBNL1Fl/Fl和Fl-Tcf21iCre小鼠進(jìn)行MI處理后，用EdU標(biāo)記增值細(xì)胞，作者發(fā)現(xiàn)在Fl-Tcf21iCre小鼠心臟中，增殖細(xì)胞約占45%，對照組約為31%。由于增殖加強(qiáng)通常與去分化有關(guān)，因此作者進(jìn)行了心臟成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析，進(jìn)而探究敲除MBNL1是否可以促進(jìn)損傷響應(yīng)中的去分化。與MBNL1Fl/Fl組相比，F(xiàn)l-Tcf21iCre成纖維細(xì)胞中的一些心臟成纖維細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄本顯著降低。同時(shí)，已有研究顯示，EMT(epicardial to mesenchymal transition, 心外膜向間充質(zhì)過渡)的其他驅(qū)動(dòng)因素，如Zeb1和Slug以及心外膜發(fā)育基因Aldh1a2,Aldh1a1和Tbx18，也在Fl-Tcf21iCre心臟成纖維細(xì)胞中上調(diào)，表明MBNL1缺失的心臟成纖維細(xì)胞比野生型更具可塑性。

　　EMT調(diào)節(jié)基因表達(dá)的改變并不能最終確定這些信號是否與MBNL1在成纖維細(xì)胞命運(yùn)或心外膜的重新激活有關(guān)，因此，作者進(jìn)行了單細(xì)胞測序?qū)嶒?yàn)(single cell RNA-seq, scRNA-seq)。他們期望在MBNL1細(xì)胞群中出現(xiàn)一種獨(dú)特的具有心外膜祖細(xì)胞特征或擴(kuò)張?zhí)卣鞯某衫w維細(xì)胞亞狀態(tài)。出人意料的是，F(xiàn)l-Tcf21iCre心臟成纖維細(xì)胞群中心外膜和心外膜/間皮細(xì)胞簇完全不存在，而這些心外膜細(xì)胞群在NTGs中擴(kuò)大，作者認(rèn)為這是心肌梗死后第1至5天內(nèi)發(fā)生的正常心外膜重新激活和擴(kuò)大。隨后，通過聯(lián)合分析scRNA-seq和RNA-seq數(shù)據(jù)，作者對MBNL1-Tg和MBNL1-null心臟成纖維細(xì)胞進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)MBNL1功能的獲得和喪失導(dǎo)致了完全相反的命運(yùn)決定，證明MBNL1作為轉(zhuǎn)錄后開關(guān)調(diào)控成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞狀態(tài)的轉(zhuǎn)換。

　　最后，作者對MBNL1如何驅(qū)動(dòng)MI后心臟成纖維細(xì)胞狀態(tài)發(fā)生改變進(jìn)行了探索。作者根據(jù)以下3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了數(shù)據(jù)挖掘: MBNL1結(jié)合因子，肌成纖維細(xì)胞分化的誘導(dǎo)因子和MI后的Fl-Tcf21iCre心臟成纖維細(xì)胞中下調(diào)的轉(zhuǎn)錄因子。最終篩選了唯一能夠同時(shí)滿足這3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的基因Sox9(一種對 EMT 和肌成纖維細(xì)胞形成至關(guān)重要的轉(zhuǎn)錄因子)。與損傷后的靜息態(tài)成纖維細(xì)胞相比，損傷后的肌成纖維細(xì)胞中的Sox9表達(dá)上調(diào)了8.5倍;相反，Sox9陽性的成纖維細(xì)胞的百分比在心肌梗死Fl-Tcf21iCre心臟中下調(diào)了2.5倍。在MBNL1Fl/Fl和Fl-Tcf21iCre心臟成纖維細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Sox9足以誘導(dǎo)aSMA陽性肌成纖維細(xì)胞，說明Sox9可以獨(dú)自促進(jìn)肌成纖維化狀態(tài)，進(jìn)而在MBNL1-null成纖維細(xì)胞中拯救分化缺陷。那么MBNL1是否可以穩(wěn)定Sox9轉(zhuǎn)錄本?作者在MBNL1Fl/Fl和Fl-Tcf21iCre心臟成纖維細(xì)胞中進(jìn)行了mRNA衰減實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，F(xiàn)l-Tcf21iCre成纖維細(xì)胞中Sox9的表達(dá)比BNL1Fl/Fl對照組中的少53%，說明Fl-Tcf21iCre心臟成纖維細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄本衰減更快。在MBNL1Fl/Fl和Fl-Tcf21iCre心臟成纖維細(xì)胞中表達(dá)MBNL1均可以上調(diào)Sox9的表達(dá)水平。這些數(shù)據(jù)表明，心肌梗死后，MBNL1通過穩(wěn)定心肌成纖維細(xì)胞中的Sox9轉(zhuǎn)錄本，進(jìn)而促進(jìn)肌成纖維細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變。

　　總的來說，該研究顯示MBNL1通過調(diào)節(jié)損傷誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞狀態(tài)動(dòng)態(tài)，進(jìn)而調(diào)控不良的心肌重構(gòu)和纖維化瘢痕的性質(zhì)?？刂萍〕衫w維細(xì)胞可逆性的能力為解決纖維化的臨床負(fù)擔(dān)帶來了很大的希望，因?yàn)橥ㄟ^藥物或遺傳手段防止肌成纖維細(xì)胞活性的誘導(dǎo)和維持可以顯著防止心臟和其他組織的纖維化重塑。靶向成纖維細(xì)胞可塑性背后的轉(zhuǎn)錄后機(jī)制是一種很有前景的方法，因?yàn)榇蠹s1/3的基因表達(dá)變化受轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)的影響。作者認(rèn)為MBNL1具有良好的治療性能，因?yàn)樗{(diào)節(jié)心臟創(chuàng)傷愈合和修復(fù)所需的成纖維細(xì)胞功能的多個(gè)層面，但依舊還需要更多的研究來了解MBNL1在其他模型(如慢性應(yīng)激)中調(diào)節(jié)細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變的作用。同時(shí)，作者認(rèn)為在Sox9機(jī)制方面還缺乏體內(nèi)證據(jù)來證實(shí)Sox9可以拯救心臟的纖維化反應(yīng)，這一信息將有助于更好地理解RNA結(jié)合蛋白在控制心肌纖維化中的治療潛力。

轉(zhuǎn)自網(wǎng)絡(luò)如有侵權(quán)請聯(lián)系刪除！