近日，韓國大田的基礎科學研究所(Institute for Basic Science，IBS)基因組工程中心的研究團隊開發(fā)了一種可編程工具，并在Cell發(fā)表了“Targeted A-to-Gbase editing in human mitochondrial DNA with programmable deaminases”(圖1)的論文。研發(fā)人員將這個新的基因編輯平臺，稱為轉錄激活因子樣效應子相關脫氨酶(TALED)。TALED是能夠在線粒體中進行A到G堿基轉換的堿基編輯器。這一發(fā)現(xiàn)是長達數(shù)十年治愈人類遺傳疾病之旅的結晶，為治愈多種線粒體遺傳病帶來了新的生機!TALED被認為是基因編輯技術缺失的最后一塊拼圖。

　　從1968年第一次發(fā)現(xiàn)限制性內切酶、1985年發(fā)明聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)到2013年突破CRISPR介導的基因組編輯技術，生物技術的每一次新突破都進一步提高了人類研究DNA、設計生命藍圖的能力(圖2)。特別是最近開發(fā)的“基因魔剪技術”——CRISPR-Cas，允許對活細胞進行全面的基因組編輯。這為科學家們通過編輯基因組中的突變基因，用以治療以前根本無法治愈的遺傳疾病開辟了新的可能性。

　　然而，雖然基因編輯技術在細胞核基因組取得了巨大成功，但科學家們在編輯具有線粒體基因組方面一直沒有突破性成果。線粒體，即所謂的“細胞發(fā)電站”，是細胞中的微小細胞器，可作為能量產生工廠。由于它是能量代謝的重要細胞器，如果基因發(fā)生突變，就會導致身體出現(xiàn)與能量代謝相關的嚴重遺傳疾病?；蚪M工程中心主任KIM Jin-Soo解釋說：“線粒體DNA的缺陷會導致人體出現(xiàn)一些非常嚴重的遺傳性疾病。例如，導致雙眼突然失明的Leber遺傳性視神經病變(LHON)就是由線粒體DNA中的單點突變引起的。” 另一種與線粒體基因相關的疾病是線粒體腦肌病(MELAS)，這種疾病伴有乳酸酸中毒和中風樣發(fā)作的癥狀，這種疾病會緩慢地破壞患者的大腦。有研究甚至表明，線粒體DNA異常也可能是阿爾茨海默病和肌肉萎縮癥等退行性疾病的誘因。 人類線粒體基因組屬母系遺傳，線粒體DNA中有90種已知的致病點突變，5000人中至少有1人會受影響。受線粒體傳遞方式的限制，許多現(xiàn)有的基因組編輯工具都無法使用。例如，CRISPR-Cas平臺并不適用于編輯線粒體中的突變，因為引導RNA本身無法進入細胞器。

　　“另一個問題是缺乏這些線粒體疾病的動物模型。這是因為目前不可能設計出創(chuàng)建動物模型所需的線粒體突變，”Kim補充說。“缺乏相關動物模型使得開發(fā)和測試這些疾病的治療方法變得非常困難。”因此，開發(fā)可靠的線粒體DNA編輯技術就成為基因組工程的前沿技術任務之一，多年來世界上最優(yōu)秀的一批科學家都在致力于這一技術的開發(fā)，探索并試圖征服所有已知的遺傳疾病。

　　2020年，由哈佛大學布羅德研究所和麻省理工學院的David R. LIU領導的研究團隊創(chuàng)建了一種新的堿基編輯器——名為DddA衍生的胞嘧啶堿基編輯器 (DdCBEs)，可以在線粒體中的DNA進行C-to-T轉換。這是通過創(chuàng)建堿基編輯的新基因編輯DdCBEs技術實現(xiàn)的，該技術在不破壞DNA的情況下將單個核苷酸堿基轉換為另一個堿基。然而，這種技術也有其局限性：它限于C-to-T轉換，還限于TC基序，它的功能僅能做TC-TT堿基轉換器。這意味著它只能糾正90個確認的致病性線粒體中的9個點突變。一直以來，人們甚至認為線粒體DNA難以實現(xiàn)從A到G的轉換。 論文的第一作者CHO Sung-Ik說：“我們開始想辦法突破這些限制，并創(chuàng)建了一個名為TALED的新型基因編輯平臺，可以實現(xiàn)線粒體中A到G的轉換。TALED很大程度擴大了線粒體基因組編輯的范圍，不僅可以為建立疾病模型做出重大貢獻，還可以為遺傳病治療貢獻不容小覷的力量。”這次研究的突破點在于，僅能在人類mtDNA 中進行A到G轉換就可以糾正90種已知致病突變中的39種(占比43%)。

　　研究過程歷經多次的試錯，研究人員通過融合三個不同的組件創(chuàng)建了TALED。第一個組件是是轉錄激活因子樣效應子(TALE)，它能夠呈現(xiàn)靶向DNA序列。第二個組件是TadA8e，一種促進A到G轉換的腺嘌呤脫氨酶。第三個組件DddA tox是一種胞嘧啶脫氨酶，它使DNA更容易被TadA8e識別

　　TALED另一個神秘的功能是TadA8e能夠在具有雙鏈DNA(dsDNA)的線粒體中進行A到G編輯，令人疑惑的地方在于TadA8e是一種已知僅對單鏈DNA具有特異性的蛋白質。Kim教授對此也感到很意外：“以前沒有人想過使用TadA8e在線粒體中進行堿基編輯，因為它應該只針對單鏈DNA。正是這種跳出教條框架的思維方式真正幫助我們發(fā)明了TALED。”研究人員對這個現(xiàn)象進行推測，DddA tox允許通過瞬時展開雙鏈來訪問dsDNA。這個轉瞬即逝的時間窗口允許TadA8e這種超速效酶，快速進行關鍵的編輯動作。除了調整TALED的組件外，研究人員還開發(fā)了一種能夠同時進行A-to-G和C-to-T堿基編輯以及僅A-to-G堿基編輯的衍生技術。 研究人員還通過這項線粒體DNA編輯新技術來實現(xiàn)單細胞衍生克隆。結果表明，TALED編輯技術既沒有細胞毒性，也不會導致線粒體DNA不穩(wěn)定。此外，在核DNA中沒有不良的脫靶編輯，線粒體DNA中的脫靶效應也很少。

　　研究人員表示，下一步的目標是通過提高編輯效率和特異性來進一步改進TALED這項技術，最終為糾正胚胎、胎兒、新生兒或成年患者中引起疾病的線粒體DNA突變鋪平道路。研究團隊還專注于開發(fā)適用于葉綠體DNA中A到G堿基編輯的TALED，葉綠體DNA編碼植物光合作用中的必需基因。 基礎科學研究所科學傳播者蘇威廉對TALED這項技術稱贊道：“我相信這一發(fā)現(xiàn)的意義可與2014年獲得諾貝爾獎的藍色LED的發(fā)明相媲美。就像藍色LED是讓我們擁有高能效白光LED光源的最后一塊拼圖一樣，預計TALED將迎來基因組工程的新時代。”