作為一種惡性程度非常高的腫瘤，肝癌在全世界范圍內的發(fā)病率和死亡率都位居前列。我國國家癌癥中心最新數據顯示，肝癌導致的死亡排名第二位，是我國人民極大的健康負擔。其中，肝細胞癌(HCC)是肝癌的主要亞型，占據原發(fā)性肝癌的75%-85%。針對HCC治療策略的開發(fā)和改進一直是迫切的臨床需求。

　　眾所周知，針對PD-1和CTLA-4的免疫檢查點抑制劑(ICB)已被廣泛用于癌癥治療，對多種晚期癌癥有療效。ICB單藥的臨床數據顯示，納武利尤單抗和帕博利珠單抗分別在晚期HCC患者治療中達到15%和18.3%的客觀緩解率(ORR)。但同時，ICB在約20%的患者中引起了3級或以上的免疫相關不良事件(irAE)。

　　聯(lián)合免疫療法雖然提高了HCC患者的ORR，但irAEs發(fā)生率也隨之增加。例如，抗PD-1聯(lián)合抗CTLA-4的ORR為31%，3/4級irAEs的發(fā)生率為37%;抗PD-L1聯(lián)合抗血管內皮生長因子-A(VEGF-A)的ORR為27.3%，3/4級irAEs的發(fā)生率為56.5%。因此，要改善HCC患者的免疫治療結果，就必須先消除ICB的副作用。

　　近日，由新加坡國立癌癥中心的David Tai和新加坡國立大學的Valerie Chew領銜的團隊，在Journal of Hepatology期刊發(fā)表重要研究成果 。

　　通過深度單細胞免疫分析，他們發(fā)現HCC患者的血液樣本中不同的抗原遞呈細胞(APC)和效應記憶T細胞(TEM)亞型，可作為區(qū)分ICB應答和副作用的生物標志物。而通過控制僅影響ICB副作用產生的免疫通路，他們在小鼠模型中證實，TNFR2抑制可以在保證ICB治療效果的同時消除免疫治療的副作用。

　　研究人員首先收集了在新加坡接受抗PD-1治療的HCC患者(以下簡稱SG組)治療前和治療中的血液樣本，通過質譜流式細胞術(CyTOF)和單細胞測序研究了ICB應答和irAEs的發(fā)生機制以及生物標志物。接下來他們進行了多輪驗證，包括收集來自韓國的HCC患者樣本(以下簡稱KR組)作為獨立驗證組，用流式細胞術驗證他們從SG組分析中發(fā)現的生物標志物，對SG組治療前和治療后1周的腫瘤活檢樣本進行批量測序分析，最后使用小鼠HCC模型進行治療驗證。

　　研究者們對所有患者(SG+KR)進行了兩種分組。根據ICB治療結果，患者被分為有反應者(Res，即部分緩解[PR]或疾病穩(wěn)定[SD]≥6個月的患者)和無反應者(Non-Res，即6個月內有疾病進展的患者)。6個月的時間點是根據Checkmate040研究判定，其結果顯示接受納武利尤單抗治療的HCC患者中，SD≥6個月的患者占比37%。

　　根據是否有過irAEs副作用發(fā)生，患者被分為不良反應組(Tox，即經歷過2級[G2]或以上irAE的患者)，和無不良反應組(non-Tox，即經歷過G1或無irAE)。值得注意的是，G2 irAE是考慮干預或中斷ICB的指標。為了找到可以在治療早期預測ICB應答或篩查irAEs高風險患者的生物標志物，研究者們選取了SG組中治療前和治療早期(<6周)的樣本(n=21)。

　　通過分析6個Res與六個Non-Res樣本的CyTOF結果，研究者們發(fā)現了三個在Res組中富集的T細胞簇：FoxP3+CD4+T細胞(C33)，FoxP3+CTLA4+CD4+調節(jié)性T細胞(Treg)(C3)，以及CD8+CD45RO+CCR7-CXCR3+TEM(C76)。此外，他們還發(fā)現了兩個不同的CD11c+髓細胞簇，在Res組富含的HLADRhiCD86+APC簇(C4)，和在Non-Res組富含的CD14+HLADRlo/-，疑似髓源性抑制細胞簇(MDSCs)(C37)。

　　ICB Res和Non-Res患者的血液中有不同免疫細胞亞型

　　接下來，研究者們用流式細胞術對SG和KR組樣本進行了驗證，對ICB有較好反應的Res組患者血液中普遍有更多Treg，APC，和CXCR3+CD8+TEM細胞。此外，多變量分析顯示，這些生物標志物與Res組更好的無進展生存期(PFS)顯著相關。其中CXCR3+CD8+TEM和APC的富集是PFS的獨立預測因子。更重要的是，irAEs分組后的分析顯示，CXCR3+CD8+TEM和APC仍然在SG和KR兩組的Res患者中顯著富集，尤其是在Non-Tox患者中。這些數據表明，外周血CXCR3+CD8+TEM和APC是HCC ICB治療預后的獨立預測因子。

　　接下來，研究者們分析了在Tox患者irAEs發(fā)生期間或±兩周內采集的血液樣本，并與在相同時間點采集的Non-Tox患者樣本進行了對比。結果顯示，Tox組的血樣中富含兩個CXCR3+CD38+CD16+CD56+NK細胞簇(C89，C99)，而Non-Tox患者血樣則富含三個CD8+T細胞簇，兩種TEM(CD45RO+CCR7-;C66，C76)和粘膜相關不變T(MAIT)細胞(V?7.2+CD161+CD56+CD8+，C96)，以及一個髓細胞簇(CD11c+CD14+HLADR+，C27)。流式細胞術的驗證結果也顯示出相同的趨勢。

　　有趣的是，前文所提到的在Res組中發(fā)現的CXCR3+CD8+TEM(C76)同樣在Non-Tox組中富集。在不考慮ICB應答的情況下，以上五種免疫亞群(NK，CD8 T，TEM，MAIT，APC)代表了與irAEs相關的生物標志物。

　　與ICB副作用相關的外周血免疫細胞

　　為了更深入地了解上述免疫亞群，研究者們對10個外周血樣本進行了單細胞測序，其中包括9個治療中期樣本(6個Res和3個Non-Res;5個Tox和4個Non-Tox)和一個治療前樣本(Res/Tox)。利用差異基因表達分析(DEG)，他們從59980個單細胞中識別出了29個簇。其中，Treg(CD3D+CD4+FOXP3+CTLA4+IL2RA+)簇，和表達ITGAX(CD11c)，HLA-DPA1，THBD(CD141)和CLEC9A的常規(guī)I型樹突狀細胞(cDC1)APC簇，在Res中顯著富集。兩個表達CD14和ITGAX(CD11c)的髓細胞簇，CD14-1和CD14-3，則與Non-Tox相關。研究者們還發(fā)現，這些CD14+簇高表達KLF4和CLEC7A，這是巨噬細胞向免疫抑制性極化的標志。

　　為了破譯ICB應答和irAE這兩個不同臨床指標背后的免疫機制，研究者們將目光轉向了與這兩種事件都相關的CD11c+APC。Res患者富集的cDC1簇表達了高水平的HLA相關基因，表明這些細胞具有優(yōu)秀的的抗原呈遞能力。CD11c+APC的基因集富集分析(GSEA)也驗證了這些細胞的功能性，這些細胞的轉錄組富集了包括抗原加工和MHC II類呈遞，T細胞共刺激，干擾素-γ信號傳導等重要的免疫啟動相關基因集。與Non-Tox相關的其他兩個髓細胞簇(CD14-1和CD14-3)的對比顯示，CD14-1比CD14-3表達了更高水平的抗原呈遞HLA相關基因，而CD14-3則表達了更高水平的免疫抑制性細胞受體STAB1(Clever-1)GSEA分析也顯示，相對于CD14-1，與Non-Tox更顯著相關的CD14-3減少了抗原呈遞和炎癥特征的基因集，因此更具備免疫抑制性表型。

　　研究者們也對前文中與ICB應答和irAEs相關的重要CD8+T細胞簇(CXCR3+TEM)進行了單細胞測序分析。他們發(fā)現，與所有其他T細胞相比，CXCR3+TEM上調了包括抗原呈遞，HLA(s)，炎癥，顆粒酶，和細胞增殖的多個基因，例如MKI67。相反，CCR7，IL7R和LEF1等幼稚T細胞基因在CXCR3+TEM中表達下調，表明這些T細胞有效應記憶表型。GSEA分析也不出所料的呈現出包括炎癥反應，細胞溶解，抗原加工以及通過MHC II類呈遞等基因集在CXCR3+TEM中富集。

　　這些結果都顯示，與其他T細胞相比，CXCR3+CD8+TEM呈現出強炎癥和細胞溶解力表型。

　　鑒于全身免疫是一個動態(tài)的系統(tǒng)，各種細胞串擾都可能影響整個大環(huán)境的免疫功能，研究者們還使用CellPhoneDB[11]對CXCR3+CD8+TEM轉錄組中受體和配體的表達進行了識別，以預測它們與其他免疫細胞的通訊。

　　他們發(fā)現，可促進炎癥和腫瘤發(fā)生的三種受體，淋巴毒素α(LTA)受體，腫瘤壞死因子受體超家族(TNFRSF1A，1B)，和淋巴毒素β受體(LTBR)[12]均在Res和Tox組的CXCR3+CD8+TEM細胞樣本中富集。也就是說，這些細胞擅長與其他細胞形成促炎相互作用，從而導致ICB應答和irAEs。

　　此外，研究者們還觀察到CXCR3+CD8+TEM和髓細胞群之間存在明顯的TNF相互作用。Res患者的TEM和APC之間主要進行的是TNF-TNFRSF1B(TNFR2)信號傳導，Non-Tox患者則是TNF-TNFRSF1A(TNFR1)信號傳導。TNF與TNFR1和TNFR2的相互作用在巨噬細胞活化和炎癥中有著重要角色。

　　研究者們用流式細胞術測定了TNF?，TNFR1，和TNFR2的蛋白質表達。他們發(fā)現，Res組的CXCR3+CD8+TEM細胞比Non-Res組表達了更高的TNF?。

　　在髓細胞的對比中，Non-Tox組的CD14+單核細胞和CD14-CD11c+HLA-DR+樹突狀細胞(DC)比Tox組增加了TNFR1表達。而對比Res和Non-Res組時，研究者們發(fā)現單核細胞和DC上的TNFR2表達沒有顯著差異。

　　也就是說，ICB應答(Res)中TNF信號作用的增加主要是由TNF?上調驅動的，而在沒有irAEs(Non-Tox)的患者中，主要是由于TNFR1表達增加。這表明，我們可以利用不同的TNF信號通路來解耦ICB應答和irAEs的產生，在保留治療效果的同時抑制副作用的發(fā)生。

　　為了驗證這個假設，研究者們用小鼠模型進行了抗PD-1和/或抗TNFR1或抗TNFR2的治療試驗。

　　經過四輪治療，腫瘤結節(jié)在所有聯(lián)合治療組的小鼠中都顯著減少，而接受抗PD-1+抗TNFR2聯(lián)合治療的小鼠腫瘤負荷為零。

　　研究者們還觀察到，抗PD-1+抗TNFR1治療組小鼠的肝臟/體重比顯著增高，而小鼠沒有體重或腫瘤負荷上的明顯變化，這側面說明了這組小鼠表現出了肝臟肥大和炎性副作用。這項結果也證實了研究者們之前在Non-Tox患者中觀察到的TNFR1增加有防止irAEs的保護作用。令人驚喜的是，抗PD-1+抗TNFR2治療組的小鼠副作用水平和對照組一致，并成功清除了腫瘤，這些結果給研究者們的假設提供了有力的支持。

　　研究者們認為，TNFR2抑制之所以能在保護ICB作用的情況下降低副作用炎性反應，是因為TNFR2優(yōu)先表達于高免疫抑制型Treg細胞上。為了驗證這個假設，研究者們從患者外周血，非腫瘤肝臟，和HCC樣本中分選了Treg和腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)進行對比。他們發(fā)現，與TIL中的其他細胞相比，Treg的TNFRSF1B(TNFR2)表達顯著高于TNFRSF1A(TNFR1)。與來自外周血的或非腫瘤肝臟組織的Treg相比，TIL-Treg的TNFRSF1B表達也顯著增高。這些發(fā)現證明，TNFR2特異表達于HCC TIL中的Treg細胞，抑制后可以增強抗腫瘤反應，并不會增強全身副作用。

　　此外，研究者們還在所有抗PD-1治療組(單藥或聯(lián)合治療)的小鼠腫瘤中觀察到了CXCR3+CD8+T細胞和CD11c+MHCII+XCR1+cDC1細胞數量的增加。前文提到，這些免疫亞型是HCC患者外周血中與ICB應答相關的生物標志物，相似的免疫亞型或是小鼠腫瘤浸潤中起到關鍵抗癌作用的細胞。

　　小鼠腫瘤浸潤免疫細胞

　　總的來說，這項研究成果揭示了HCC患者外周血TEM和APC與ICB治療應答和irAEs都有重要關系，免疫應答和irAEs反應是由TEM和APC之間不同的TNF信號通路所促成的。因此，通過阻斷造成irAEs的TNFR2信號傳導可實現ICB副作用的消除，這對未來HCC患者的ICB療效早期檢測和聯(lián)合免疫療法的改進都有重要的意義。

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