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高效液相色譜法基礎(chǔ)知識篇

  高效液相色譜法(HPLC)具有高壓、高效、高速、高靈敏度、高選擇性等特點,廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、環(huán)保、石化、食品、化工等行業(yè),是現(xiàn)在分離分析的重要方法,本文著重介紹HPLC的工作原理、基本組成及高效液相色譜名詞術(shù)語,使新學(xué)者快速了解高效液相色譜知識,在日常操作中理論與實踐結(jié)合,確保HPLC的高效運行、快速分析。

  1HPLC工作原理

  100多年前俄國植物學(xué)家Tswett(茨維特) 他將植物色素的石油醚提取液倒入裝有碳酸鈣的直立玻璃管,再加入石油醚使其自由流下,結(jié)果色素中各組份互相分離形成各種不同顏色的譜帶,Tswett用希臘語chroma(色)和graphos(譜)描述他的實驗方法,即現(xiàn)在的Chromatography(色譜法)

  色譜法是通過是利用混合物中各組份在不同的兩相中溶解、分配、吸附等化學(xué)作用性能的差異,當兩相作相對運動時,使各組分在兩相中反復(fù)多次受到上述各作用力而達到相互分離,色譜法的本質(zhì)是分離分析方法。

  色譜分離原理

  兩相中的一相是固定的,叫作固定相(Stationary Phase),一相是流動的,叫作流動相(Mobile Phase),又叫洗脫劑。用液體作為流動相的,即為液相色譜(Liquid Chromatography, LC)。

  HPLC為High Performance Liquid Chromatography的縮寫(High高、Performance性能、Liquid液體的、Performance 色譜),是一種區(qū)別于經(jīng)典液相色譜,基于儀器方法的高效能分離手段,具有高壓、高效、高速、高靈敏度、高選擇性等特點。

  2HPLC分類

  按固定相和流動相的相對極性分為正相色譜(NormalPhaseChromatography)和反相色譜(Reversed Phase Chromatography)。

  正想色譜:固定相的極性大于流動相。

  反相色譜:固定相的極性小于流動相。

  有機化合物極性是指分子間作用力(靜電引力、偶極力、色散力、氫鍵力)綜合表現(xiàn)的一種表述。

  按分離過程的機理分為吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜和體積排除色譜。

  吸附色譜(Absorption Chromatography):根據(jù)樣品組分對活性固定相表面吸附親和力的不同實現(xiàn)分離。

  分配色譜(Partition Chromatography):分離基于樣品組分在固定相和流動相中的溶解度(分配系數(shù))不同。

  離子交換色譜(Ion Exchange Chromatography):根據(jù)樣品組份離子交換親和力的差異分離,簡稱離子色譜(IC)。

  體積排除色譜(Size Exclusion Chromatography):分為GPC和GFC。

  GPC(Gel Permeation Chromatography凝膠滲透色譜又稱尺寸排阻色譜):固定相是疏水性凝膠,流動相是水或緩沖溶液-有機溶劑。

  GFC(Gel Filtration Chromatography凝膠過濾色譜又稱水系凝膠色譜):固定相是親水性凝膠,流動相是水或緩沖溶液。

  3HPLC組成

  HPLC由溶劑輸送系統(tǒng)(脫氣機、高壓泵等)、進樣系統(tǒng)(定量泵、六通閥、定量環(huán)、進樣針等)、分離系統(tǒng)(色譜柱等)、檢測系統(tǒng)(檢測器等)、記錄及數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。

  高壓輸液泵:將流動相在高壓下連續(xù)不斷地送入液路系統(tǒng),具有有足夠的壓力,輸出流量恒定、可調(diào),輸出壓力平穩(wěn),泵室體積小,泵體抗腐蝕、耐酸等特點。

  壓力平穩(wěn)、流速恒定是HPLC系統(tǒng)穩(wěn)定、重現(xiàn)性良好的前提條件,多數(shù)的HPLC故障、色譜數(shù)據(jù)異常均會表現(xiàn)出壓力異常,如偏高、偏低、波動大等,在日常使用中需要特別關(guān)注壓力變化。

  在線脫氣機:四元低壓系統(tǒng)屬于泵前混合,由于在常壓下混合,極易產(chǎn)生氣泡,必須配有在線脫氣機,并要求流動相使用前進行脫氣,流動相脫氣得目的如下:

  使色譜泵輸液均勻準確,減小脈動。 提高保留時間和色譜峰面積的重現(xiàn)性。 防止氣泡引起尖峰。 使基線穩(wěn)定,提高信噪比。 降低溶劑的紫外吸收本底。 減少死體積。 防止填料氧化。

  進樣系統(tǒng):分為手動進樣系統(tǒng)和自動進樣系統(tǒng), 主要由定量環(huán)、六通閥、進樣針等部件組成。手動進樣系統(tǒng)的定量環(huán)用于準確定量,分為5μl、10μl、20μl等,需要根據(jù)不同進樣量選擇合適的定量環(huán);自動進樣系統(tǒng)儀器自帶定量環(huán)多為100μl,如進樣量大于定量環(huán)體積需咨詢相應(yīng)儀器工程師更換定量環(huán)及計量泵等,六通閥是最理想的進樣部件,由圓形密封墊(轉(zhuǎn)子)和固定底座(定子)組成,通過閥切換保證恒定的流速,下圖為六通閥不同狀態(tài)流路示意圖。

  分析液相多數(shù)配自動進樣系統(tǒng),自動進樣系統(tǒng)具有進樣精度高、重現(xiàn)性好、可用于大量樣品分析等特點。

  分離系統(tǒng):包括色譜注、柱溫箱,連接管線等部件。

  色譜柱一般用內(nèi)部拋光的不銹鋼制成。其內(nèi)徑為2~6mm,柱長為10~50cm,柱形多為直形,內(nèi)部充滿3~10 μm高效微粒固定相,根據(jù)不同的實驗需求需要選擇不同填料、不同規(guī)格的色譜柱。

  柱溫箱:保證分離系統(tǒng)的溫度恒定,降低溫度波動對色譜基線、保留時間及色譜分離的影響,包括普通柱溫箱及帶有冷卻功能的柱溫箱,普通柱溫箱可以根據(jù)方法需求設(shè)定高于室溫的溫度(一般應(yīng)高于室溫5℃以上),降低柱壓或是改善色譜分離,帶有冷卻功能的柱溫箱可以升高柱溫外,還可以設(shè)定低于室溫的溫度,預(yù)防穩(wěn)定性差樣品的降解,各品牌柱溫箱的控溫范圍略有差別,需要通過相應(yīng)產(chǎn)品說明書或咨詢客服了解。

  需要特別注意的是有些品牌的柱溫箱是沒有配置預(yù)加熱模塊的,對于溫度敏感的樣品需要在柱前連接一段管線,對流動相進行預(yù)加熱,管線長度及內(nèi)徑需適當,盡量降低死體積。

  檢測器:包括紫外可見吸收檢測器(UVD)、熒光檢測器(FD)、蒸發(fā)光檢測器(ELSD)、示差折光檢測器(RID)、電化學(xué)檢測器(ED)、化學(xué)發(fā)光檢測器(CD)、質(zhì)譜檢測器(MS)等類型,其技術(shù)要求為靈敏度高、噪音低、線形范圍寬、響應(yīng)快。

  紫外可見吸收檢測器(UVD):波長范圍190~800mm,190~400mm為紫外區(qū)域,氘燈,400~800mm為可見光區(qū)域,鎢燈。其特點為靈敏度高,最小檢測濃度10-9g/ml,線性范圍寬,對溫度和流速不敏感,可進行梯度洗脫,應(yīng)用范圍廣。適用于帶有共軛基團的化合物,為最常用的檢測器。

  熒光檢測器(FD):氘燈作激發(fā)光源,波長范圍250~600nm。其特點為靈敏度更高,檢測限10-12~10-13g/ml(靈敏度比UV檢測器高2~3個數(shù)量級),選擇性好,對溫度和流速不敏感,可進行梯度洗脫,所需試樣量少,適于痕量分析,應(yīng)用于組分吸收一定波長紫外光后發(fā)射熒光的物質(zhì),且熒光強度與濃度成正比。

  蒸發(fā)光檢測器(ELSD):是一種通用型的檢測器,可檢測揮發(fā)性低于流動相的任何樣品,而不需要樣品含有發(fā)色基團。蒸發(fā)光散射檢測器靈敏度比示差折光檢測器高,對溫度變化不敏感,基線穩(wěn)定,適合與梯度洗脫液相色譜聯(lián)用。被廣泛應(yīng)用于碳水化合物、類脂、脂肪酸和氨基酸、藥物以及聚合物等的檢測。其主要缺點為響應(yīng)值與濃度不呈線性,需取響應(yīng)值的對數(shù)與濃度計算線性。

  示差折光檢測器(RID):是一種連續(xù)檢測樣品流路與參比流路間液體折光指數(shù)差值的通用型檢測器,其優(yōu)點為對糖類檢測靈敏度較高,其檢測限可達10-8g/ml;穩(wěn)定性好,操作方便,缺點該檢測器對多數(shù)物質(zhì)的靈敏度低(約10-5g/ml),通常不用于痕量分析;受環(huán)境溫度、流動相組成等波動的影響較大,不適合梯度洗脫。

  質(zhì)譜檢測器(MS):將樣品中的分析物電離,不同質(zhì)量離子在電場或磁場中,將按其質(zhì)量和所帶的電荷比(質(zhì)荷比,m/z)進行的分離和排序,根據(jù)質(zhì)荷比的大小和相對強度形成規(guī)則的質(zhì)譜,從而對物質(zhì)進行結(jié)構(gòu)鑒別和定量分析。質(zhì)譜分析具有靈敏度高,樣品用量少,分析速度快,分離和鑒定同時進行等優(yōu)點,但流動相中不能含有無機鹽。

  4HPLC名詞術(shù)語

  色譜圖(Chromatogram) : 色譜柱流出物通過檢測器時所產(chǎn)生的響應(yīng)信號對時間的曲線圖,其縱坐標為信號強度,橫坐標為時間。

  色譜峰(Peak):色譜柱流出組分通過檢測器時產(chǎn)生的響應(yīng)信號。

  峰底(Peak Base):峰的起點與終點之間連接的直線。

  峰高(Peak Height):峰最大值到峰底的距離。

  峰面積(Peak Area):峰與峰底之間的面積,又稱響應(yīng)值。

  基線(Baseline):在正常操作條件下,僅由流動相所產(chǎn)生的響應(yīng)信號。

  基線飄移(Baseline Drift):基線隨時間定向的緩慢變化。

  基線噪聲(N)N)(Baseline Noise):由各種因素所引起的基線波動。

  譜帶擴展(Band Broadening):由于縱向擴散,傳質(zhì)阻力等因素的影響,使組分在色譜柱內(nèi)移動過程中譜帶寬度增加的現(xiàn)象。

  保留時間(tR)(Retention time):組分從進樣到出現(xiàn)峰最大值所需的時間。

  死時間(t0)(Dead time):不被固定相滯留的組分,從進樣到出現(xiàn)峰最大值所需的時間。

  保留體積(VR)(Retention volume):組分從進樣到出現(xiàn)峰最大值所需的流動相體積。

  死體積(V0)(Dead volume):不被固定相滯留的組分,從進樣到出現(xiàn)峰最大值所需的流動相體積。

  等度:在整個運行過程中溶劑組成保持不變,如(60:40 甲醇/水)。

  梯度:在運行過程中溶劑組成變化,漸變或臺階式變化,如100%的 H20/ 0%的MeOH到0%的H2O/100%的MeOH。

  分離度:用于評價待測物質(zhì)與被分離物質(zhì)之間的分離程度,是衡量色譜系統(tǒng)分離效能的關(guān)鍵指標。除另有規(guī)定外,待測物質(zhì)色譜峰與相鄰色譜峰之間的分離度應(yīng)大1.5 ,分離度的計算實例如下圖:

  理論塔板數(shù)(N):分離效率的量度,用于評價色譜柱的分離效能。

  拖尾因子:用于評價色譜峰的對稱性。

  重復(fù)性:用于評價色譜系統(tǒng)連續(xù)進樣時響應(yīng)值的重復(fù)性能。采用外標法時,通常取各品種項下的對照品溶液,連續(xù)進樣5次,除另有規(guī)定外,其峰面積測量值的相對標準偏差應(yīng)不大于2.0%;采用內(nèi)標法時,通常配制相當于80%、100和 120%的對照品溶液,加人規(guī)定量的內(nèi)標溶液,配成3種不同濃度的溶液,分別至少進樣2次,計算平均校正因子,其相對標準偏差應(yīng)不大于2.0%。

  5 HPLC日常操作注意事項

  選擇流動相時應(yīng)注意的幾個問題:

  盡量使用高純度試劑作流動相,防止微量雜質(zhì)長期累積損壞色譜柱和使檢測器噪聲增加。 避免流動相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子。 試樣在流動相中應(yīng)有適宜的溶解度,防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。 流動相同時還應(yīng)滿足檢測器的要求。當使用紫外檢測器時,流動相不應(yīng)有較強的紫外吸收,一般檢測波長應(yīng)大于流動相的截止波長。

  泵的維護保養(yǎng):

  防止任何固體微粒進入泵體,否則會磨損柱塞、密封環(huán)缸體和單向閥,因此應(yīng)預(yù)先對流動相進行過濾,可采用Millipore濾膜(0.22μm或 0.45μm )等過濾。泵的入口都應(yīng)該連接砂濾棒(或片), 輸液泵的濾器應(yīng)經(jīng)常更換。 流動相不應(yīng)含有任何腐蝕性物質(zhì), 含有緩沖液的流動相不應(yīng)保留在泵內(nèi), 尤其是停泵過夜或更長時間。分析工作結(jié)束后必須用純水充分清洗后,再換成適合于色譜柱保存和有利于泵維護的溶劑(對于反相鍵合固定相,可以是甲醇或甲醇和水) 泵工作時要留心防止溶劑瓶內(nèi)的流動相用完,否則空泵運轉(zhuǎn)也會磨損柱塞、密封環(huán)或缸體,最終產(chǎn)生漏液。 輸液泵的工作壓力不要超過規(guī)定的最高壓力,否則會使高壓密封環(huán)變形,產(chǎn)生漏液。

  紫外檢測器維護保養(yǎng):

  流通池進入氣泡會干擾基線,并極難排出,應(yīng)使用充分脫氣的流動相,以減少氣泡的產(chǎn)生。 應(yīng)定期沖洗系統(tǒng),避免流通池干涸。 檢測器中氘燈( 光源) 隨著使用時間的增加,氘燈強度降低,噪音會不斷增大,故分析前柱平衡得差不多時,再打開檢測器,分析工作結(jié)束及時關(guān)閉檢測器(頻繁開關(guān)檢測器也會縮短檢測器壽命,一般開啟間隔少于4小時,不建議關(guān)閉檢測器)。 塵埃在靜電的作用下容易覆蓋在光學(xué)元件上, 使光傳播效率降低,增加了光散射, 影響分析效果, 因此檢測器周圍的環(huán)境應(yīng)保持清潔。

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