腸球菌(Enterococcus)是腸道中的一種共生細(xì)菌，廣泛分布于自然環(huán)境中，包括水、土壤、蔬菜肉類等食物和昆蟲、鳥類、魚類、哺乳動物等野生動物的腸道及糞便中。從20世紀(jì)70年代開始，腸球菌感染的發(fā)生率和致死率都大大上升。由于這些腸球菌擁有很強(qiáng)的耐藥性并且很容易獲取新的耐藥基因，腸球菌感染往往很危險，現(xiàn)在已成為醫(yī)院里最主要的多重耐藥細(xì)菌感染源之一。由耐藥性腸球菌而引發(fā)心內(nèi)膜炎、尿路感染和菌血癥而導(dǎo)致的患者死亡率可高達(dá)25%以上。

　　細(xì)菌蛋白外毒素是很多致病細(xì)菌的主要武器。獲得毒素基因往往是“良性”細(xì)菌演變成人和動物的主要病原菌的關(guān)鍵一步，比如非致病白喉桿菌可以通過噬菌體感染獲得表達(dá)白喉毒素的基因從而變成致病菌。腸球菌中以往并沒有發(fā)現(xiàn)專門針對人和哺乳動物細(xì)胞的蛋白毒素。本研究首次發(fā)現(xiàn)和驗證腸球菌獲得了針對人和哺乳動物細(xì)胞的蛋白毒素，揭示了腸球菌在毒力和致病機(jī)理方面令人擔(dān)憂的潛在演化，值得高度警惕。

　　蛋白毒素的發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)上是從研究已知疾病和病原菌入手，然后找到致病的毒素。很多人類的致病細(xì)菌和病毒都演化于自然界中，傳統(tǒng)研究往往受限于被動等待微生物獲取某種對人致病的能力以及等待臨床診斷上建立起某種疾病和微生物的聯(lián)系。這次的重大發(fā)現(xiàn)則是起始于從野外采集分離各種腸球菌菌株并進(jìn)行大規(guī)模基因組測序，通過生物信息學(xué)分析找到潛在的新毒素基因，然后再通過結(jié)構(gòu)和宿主受體的研究在分子水平上直接闡明毒素的功能和宿主特異性。這項研究充分運用了當(dāng)前“后基因組時代”對微生物毒力因子和潛在致病機(jī)理的研究新途徑，直接揭示了潛在病原菌和致病毒力因子的存在和機(jī)理，提供了先發(fā)治“菌”的可能性，為防治未來新興病原菌做好準(zhǔn)備。

　　這項研究的主要合作者，哈佛醫(yī)學(xué)院和博德研究所 (Broad Institute)的Michael Gilmore 教授領(lǐng)導(dǎo)的研究組在美國國立衛(wèi)生研究院資助下，長期從事對腸球菌菌株的采集和基因組測序工作。董民實驗室和Michael Gilmore實驗室合作于2018年在一個采集自美國蒙大拿州野外馬糞中的腸球菌菌株中，找到了編碼新的穿孔毒素的基因。通過進(jìn)一步的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)一共有8個類似的毒素(Epx1-8)，構(gòu)成一個特有的毒素家族。這些毒素目前已經(jīng)在近年來分離的46種腸球菌菌株中發(fā)現(xiàn)(包括分屬于E.faecalis，E. faecium和E.hirae三大類)。這些菌株的來源包括人和動物糞便、超市雞肉、廢水，和人的組織樣品等，其分布地點遍布全球五大洲 。

　　穿孔毒素是細(xì)菌的常見毒素類型。被細(xì)菌以單體形式分泌出來以后，它們會在宿主細(xì)胞膜上聚集并形成跨膜穿孔通道(pore)。穿孔毒素可以破壞宿主上皮屏障、殺死免疫細(xì)胞及組織細(xì)胞， 因此是很多病原菌的重要致病因子。典型的穿孔毒素比如α型溶血素(α-Hemolysin; Hla)，是金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)中重要的致病因子。以α型溶血素為代表的這一類穿孔毒素通常由7個單體聚合形成一個β桶(β-barrel)跨膜穿孔通道，其經(jīng)典結(jié)構(gòu)早在1996年就通過晶體結(jié)構(gòu)生物學(xué)方法解析。為了探究Epx的分子機(jī)制，董民實驗室與哈佛醫(yī)學(xué)院的Jonathan Abraham實驗室和吳皓教授實驗室合作，通過晶體學(xué)和冷凍電鏡的方法分別解析了Epx1和Epx4的結(jié)構(gòu)。結(jié)果證實Epx1和Epx4屬于β桶穿孔毒素家族(β-barrel pore-forming toxin family)。其整體結(jié)構(gòu)與傳統(tǒng)的α型溶血素家族成員比較像，包含由β-sandwich區(qū)域構(gòu)成的cap結(jié)構(gòu)域、芳香族氨基酸富集的疏水性rim結(jié)構(gòu)域和由β桶形成跨膜穿孔通道stem結(jié)構(gòu)域。有意思的是，與傳統(tǒng)β桶穿孔毒素家族形成的七聚體穿孔通道不同，Epx1和Epx4都形成了八聚的穿孔通道結(jié)構(gòu)。另外一個和已知穿孔毒素不同的地方是Epx1和Epx4都在膜外結(jié)構(gòu)域上方形成了一個額外的β桶結(jié)構(gòu) (命名為 “Top”結(jié)構(gòu)域)。對Top結(jié)構(gòu)域的幾個關(guān)鍵氨基酸殘基的突變研究表明這個結(jié)構(gòu)域?qū)px穿孔通道的形成和穩(wěn)定發(fā)揮了重要作用。這些特有的結(jié)構(gòu)特征證實Epx毒素形成β桶穿孔毒素家族中的一個獨特的分支。

　　作者進(jìn)一步通過細(xì)胞實驗揭示了上述馬糞菌株所產(chǎn)生的Epx2是毒性最強(qiáng)的穿孔毒素之一，只需要11-14 ng/mL 就可以殺死一半的HeLa細(xì)胞(IC50)。同時，他們發(fā)現(xiàn)Epx2表現(xiàn)出了一定的宿主物種選擇性，對人源和猴源細(xì)胞的毒性較高，而對狗源和鼠源細(xì)胞毒性較低。為了更深入地了解Epx2作用于人源細(xì)胞的分子機(jī)制，作者通過CRISPR-Cas9介導(dǎo)的全基因組篩選鑒別出了細(xì)胞表面的組織相容性復(fù)合物 I (major histocompatibility complex I, MHC-I，人源蛋白又稱作人白細(xì)胞抗原復(fù)合體I ，human leukocyte antigen, HLA-I) 為其特異性受體。另一毒素成員Epx3也利用MHC-I/HLA-I作為受體。這兩種毒素都可以識別人源、馬源、豬源、牛源的MHC-I，而對鼠源的MHC-I識別較弱。這些發(fā)現(xiàn)在分子水平上解釋了Epx2和Epx3對宿主的選擇特異性。

　　圖一：文章圖示摘要

　　為了探究這些毒素在腸球菌致病過程中的功能機(jī)制，作者把攜帶有Epx2基因的腸球菌株DIV0147和人源的外周血單核細(xì)胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells，PBMC)以及人源的腸道類器官(human intestinal organoids)進(jìn)行體外共培養(yǎng)。結(jié)果顯示，DIV0147腸球菌對外周血單核細(xì)胞以及腸道類器官造成了嚴(yán)重?fù)p傷。加入針對Epx2的特異抗體則可以完全中和毒性并保護(hù)這些細(xì)胞。這些發(fā)現(xiàn)揭示DIV0147腸球菌通過分泌Epx2來毒殺人源細(xì)胞，證實了含有毒素的腸球菌的潛在致病性 (圖一)。

　　作者提到當(dāng)前研究的主要局限性是尚不知道有何種人或動物的疾病是由這些新發(fā)現(xiàn)的毒素和含毒素的菌株所造成的， 這將是未來研究中的重要問題， 也希望這些新型毒素的報道可以推動對其疾病相關(guān)性的進(jìn)一步調(diào)查研究。

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