腫瘤類器官作為重要的體外細胞模型為腫瘤藥物研究提供了新的工具，相比于傳統(tǒng)的2D培養(yǎng)的腫瘤細胞系，3D培養(yǎng)的類器官可以更好地維持癌癥患者的腫瘤特征，反映腫瘤內(nèi)部的異質(zhì)性。因此，基于類器官模型的藥物篩選不僅可以發(fā)現(xiàn)新的腫瘤治療藥物，還可以用于探究不同突變類型細胞的藥物敏感性差異。盡管基于腫瘤類器官的藥物篩選助力了靶向藥物研究，但是目前藥物篩選的評價標準主要是基于增殖和凋亡等細胞表型特征，對藥物的作用機制少有分子層面的深入解析。

　　2023年6月22日，北京大學生物醫(yī)學前沿創(chuàng)新中心(BIOPIC)湯富酬團隊與北京大學第三醫(yī)院普通外科付衛(wèi)團隊合作在Protein & Cell上發(fā)表了文章Drug repurposing screening and mechanism analysis based on human colorectal cancer organoids，成功建立了基于人類結(jié)直腸癌類器官模型的體外藥物篩選和藥效評價平臺，采用“老藥新用”的策略，使用小分子藥物體外篩選手段并經(jīng)過免疫缺陷小鼠體內(nèi)移植實驗驗證，得到多種具有潛在結(jié)直腸癌治療價值的候選藥物，并在轉(zhuǎn)錄組水平對候選藥物的作用機制進行深入解析。

　　該研究的主要發(fā)現(xiàn)有：

　　1.結(jié)合藥物預測方法進行基于結(jié)直腸癌類器官的藥物篩選，在335種FDA批準的治療其他疾病的臨床藥物中，篩選得到34種潛在靶向結(jié)直腸癌的候選藥物。

　　該研究首先利用轉(zhuǎn)錄組、外顯子組和DNA甲基化組測序技術(shù)，在多組學水平上對結(jié)直腸癌類器官的分子特征進行解析、對腫瘤類器官與患者原位腫瘤的一致性進行評估。通過對比發(fā)現(xiàn)，該研究構(gòu)建的結(jié)直腸癌類器官可以很好地保留原位腫瘤組織的突變特征、重要信號通路的表達水平以及基因啟動子區(qū)域的甲基化水平。值得一提的是，該研究構(gòu)建的8個結(jié)直腸癌類器官中有3個攜帶有KRAS突變，KRAS突變是結(jié)直腸癌中最常見的突變之一，突變頻率約為30%-50%。該研究中的結(jié)直腸癌類器官同時囊括了帶有KRAS突變和不含KRAS突變的腫瘤類型，具有很好的代表性，能夠更好地體現(xiàn)各種亞型結(jié)直腸癌的腫瘤特征。

　　為了能夠篩選到毒副作用小且具有潛在的殺傷結(jié)直腸癌細胞的藥物，除了使用經(jīng)過FDA批準的治療其他疾病的藥物庫外，該研究利用已有數(shù)據(jù)庫進行條件嚴格的藥物預測，并且使用結(jié)直腸癌臨床常用藥5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil)和瑞戈非尼(Regorafenib)作為陽性對照。篩選結(jié)果顯示，在包含預測藥物的共335種藥物中，34種藥物具有潛在殺傷結(jié)直腸癌類器官的能力。

　　為了進一步確認篩選到的34種藥物對不同患者來源的結(jié)直腸癌類器官的殺傷效果，該研究在8個結(jié)直腸癌類器官系中對藥物效果進行測試。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同患者來源的類器官對34種候選藥物的敏感性不同，臨床上常用的5-氟尿嘧啶和瑞戈非尼兩種結(jié)直腸癌治療藥物也顯示出對不同的類器官系的敏感性不同，說明不同患者之間的藥物響應差別大，這說明使用類器官篩選藥物進而幫助指導患者用藥的重要性。

　　2.依據(jù)轉(zhuǎn)錄組特征將結(jié)直腸癌類器官對有效的34種候選藥物的響應分為五種模式：促分化類、抑生長類、抑代謝類、促免疫響應類和抑細胞周期類。

　　為了進一步探究篩選得到的34種候選藥物的作用機制，該研究分別對不同患者來源的腫瘤類器官進行藥物處理，收集藥物處理后的類器官樣本進行轉(zhuǎn)錄組測序，在腫瘤相關(guān)信號通路的干擾、結(jié)直腸癌腫瘤特征基因表達、腫瘤耐藥相關(guān)基因表達以及細胞分化干性四個方面對34種藥物的作用機制進行系統(tǒng)的揭示。

　　首先，該研究通過基因集富集分析探究藥物處理后類器官的細胞增殖、免疫激活、應激及代謝等腫瘤相關(guān)通路的表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，盡管篩選出的藥物都可以抑制腫瘤類器官的細胞活力，但從轉(zhuǎn)錄組水平上看，不同藥物干擾的細胞信號通路不同，說明不同藥物的作用方式不同，主要區(qū)分為5個類群，結(jié)合腸道上皮細胞標志基因的表達水平高低，該研究將5個類群進一步定義為：促分化類、抑生長類、抑代謝類、促免疫響應類和抑細胞周期類。

　　類群1為促分化類，該類群的特征為不同腸道細胞類型的標志基因的表達相對其他類群較高，說明腫瘤類器官的分化特征增強。提示類群1的藥物在殺傷腫瘤細胞的同時也可能通過促進細胞分化進而抑制腫瘤細胞的增殖。通過基因功能富集分析，發(fā)現(xiàn)該類群藥物明顯抑制腫瘤細胞的有絲分裂，并且抑制Wnt信號通路的表達。同時，與腸道吸收和分泌功能相關(guān)的基因CHGB、S100A9、SLC17A7和SLC8A2的表達上調(diào)。類群2為抑生長類，轉(zhuǎn)錄組特征為應激相關(guān)通路和代謝相關(guān)通路的干擾相對其他類群較弱，通過基因功能富集分析，發(fā)現(xiàn)該類群明顯抑制生長因子響應通路以及MAPK信號通路。類群3為抑代謝類，轉(zhuǎn)錄組特征為與代謝相關(guān)通路如糖酵解通路的表達被抑制。該類群下調(diào)的基因富集在碳水化合物代謝和氨基酸代謝等功能中。類群4為促免疫響應類，其轉(zhuǎn)錄組特征主要表現(xiàn)為免疫響應和應激響應相關(guān)通路的激活。通過基因功能富集分析，發(fā)現(xiàn)該類群的特異性高表達基因富集在嗜中性粒細胞脫顆粒、MHC-I類分子的組裝和呈遞等功能。說明該類群的藥物不僅殺傷腫瘤細胞，同時也可能通過增強腫瘤細胞抗原遞呈的效果，釋放招募免疫細胞的信號，促進免疫細胞對腫瘤細胞的殺傷作用。類群5的細胞周期等相關(guān)信號通路的表達受到抑制的程度最強，被定義為抑細胞周期類。其轉(zhuǎn)錄組特征表現(xiàn)為有絲分裂紡錘體功能被抑制、鐵死亡通路激活，且腸道細胞分化相關(guān)基因的表達下調(diào)。該類群的差異低表達基因富集在細胞有絲分裂、DNA復制和細胞周期檢查點等功能上。同時，與細胞周期和DNA復制功能相關(guān)的基因CDK1、CDKN3、CENPE和TOP2A的表達下調(diào)。

　　值得一提的是，該研究鑒定得到的抑生長類，抑代謝類和抑細胞周期類藥物的相關(guān)功能被之前的腫瘤藥物篩選研究認為是殺傷腫瘤細胞的藥物的常見功能，而促分化類和促免疫響應類的藥物除了會對腫瘤細胞直接產(chǎn)生殺傷作用之外，還會對腫瘤細胞產(chǎn)生其他特征的影響。促分化類藥物還可能使腫瘤細胞朝著更加分化的狀態(tài)轉(zhuǎn)化，從而使腫瘤細胞更容易被殺傷。促免疫響應類藥物在殺傷腫瘤細胞的同時還可能會使腫瘤細胞的抗原呈遞功能增強，從而更容易招募T細胞、髓系細胞等免疫細胞對腫瘤細胞進行殺傷。促分化類和促免疫響應類的藥物具有進一步研究和應用的潛在價值，相關(guān)的體內(nèi)實驗和臨床試驗需要進一步開展以證明其對腫瘤細胞的多方面影響。

　　根據(jù)結(jié)直腸癌類器官在藥物處理之后的轉(zhuǎn)錄組特征，該研究將腫瘤類器官對藥物的響應分為5種模式，分別為：促分化類、抑生長類、抑代謝類、促免疫響應類和抑細胞周期類。每個類群中的藥物殺傷腫瘤細胞的方式各不相同，不同類群藥物作用靶點和作用機制各有差別。

　　3.免疫缺陷小鼠體內(nèi)移植成瘤實驗驗證發(fā)現(xiàn)，曲美替尼(Trametinib)、硼替佐米(Bortezomib)和菲卓替尼(Fedratinib)三種藥物具有治療結(jié)直腸癌的潛在價值。

　　為了進一步探究候選藥物在體內(nèi)環(huán)境中的表現(xiàn)情況，該研究構(gòu)建了基于類器官的小鼠異種移植模型(patient derived organoid-based xenografts, PDOX)。結(jié)合藥物殺傷效果和其在臨床使用中的毒性情況，該研究在每個藥物響應類群中各選取了1到2種細胞殺傷效果強、臨床使用毒性小的藥物(共7個)在PDOX模型上進行體內(nèi)抑瘤實驗。通過統(tǒng)計處理后小鼠腫瘤的重量變化，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過8種藥物處理后，小鼠的腫瘤質(zhì)量的中位數(shù)都降低，說明與體外的篩選實驗結(jié)果一致，篩選得到的藥物都有潛在抑制結(jié)直腸癌腫瘤的效果。其中，除臨床常用藥物5氟尿嘧啶(5-Fluorouracil)之外，曲美替尼(Trametinib)、硼替佐米(Bortezomib)和菲卓替尼(Fedratinib)的抑制腫瘤的效果明顯。

　　為了進一步驗證體內(nèi)環(huán)境中藥物的作用效果，該研究解剖腫瘤塊進行轉(zhuǎn)錄組測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)使腫瘤明顯縮小的藥物，腫瘤細胞中細胞周期等與細胞增殖相關(guān)的信號通路表達受到明顯抑制，進一步驗證了曲美替尼、硼替佐米和菲卓替尼可能為治療結(jié)直腸癌的潛在藥物。

　　綜上，該研究建立了基于人類腫瘤類器官、并且結(jié)合實驗篩選和計算預測的藥物篩選方法，成功篩選驗證得到治療結(jié)直腸癌的潛在候選藥物。同時利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)揭示了候選藥物的作用機制和作用模式，為結(jié)直腸癌治療藥物的發(fā)現(xiàn)提供了重要的數(shù)據(jù)支持，該研究對結(jié)直腸癌的臨床治療具有潛在應用價值。

　　北京大學生物醫(yī)學前沿創(chuàng)新中心、北京大學生命科學學院毛雨諾博士(現(xiàn)山東大學基礎(chǔ)醫(yī)學院助理研究員)、博士生王維、楊經(jīng)緯博士為該論文的并列第一作者。北京大學生物醫(yī)學前沿創(chuàng)新中心湯富酬教授與北醫(yī)三院普通外科付衛(wèi)教授為該論文的共同通訊作者。

　　原文鏈接：

　　https://academic.oup.com/proteincell/advance-article/doi/10.1093/procel/pwad038/7204964

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